超声辐照微泡促进AAV转染的细胞内吞机制研究

超声辐照微泡促进AAV转染的细胞内吞机制研究
【作者】杜联芳，金利芳，李凡
【作者单位】上海交通大学附属第一人民医院超声科
【出处】第一届全国暨第二届国际超声分子影像学术会议
【年份】2014
【页码】重庆
【关键词】超声；微泡；内吞；腺相关病毒；声穿孔
【分类号】R73;R96
【摘要】目的探索超声辐照微泡介导腺相关病毒(AAV)转染时内吞为方式的细胞摄取机制.方法构建含绿色荧光蛋白基因的重组AAV2型(rAAV2-EGFP).超声辐照微泡介导rAAV2-EGFP转染人宫颈癌细胞(HeLa),采用倒置荧光镜观察和流式细胞仪检测,确定超声辐照微泡对AAV转染的促进作用,并确定超声辐照微泡的参数设置和AAV使用剂量.采用免疫荧光、Western blotting和Real-time PCR的方法,动态观察超声辐照微泡介导下AAV进入细胞的数量和分布,与单纯AAV转染比较,分析AAV进入方式与细胞内吞活动的关系.采用免疫荧光和Western blotting的方法,观察超声辐照微泡介导AAV转染时细胞网格蛋白介导的内吞活动活跃情况,并与未处理、超声辐照微泡处理和AAV转染的细胞比较.采用透射电镜观察细胞膜附近内吞泡的形态和数量.通过抑制网格蛋白介导的内吞,观察内吞抑制对超声辐照微泡促进AAV转染的影响,分析超声辐照微泡促进AAV转染对细胞内吞的依赖性.结果超声辐照微泡采用超声功率1 W/cm2、辐照时间60 s、占空比1：5和微泡体积比1：5,rAAV2-EGFP采用2000 v.g./cell剂量时,AAV转染效率提升60.41％.超声辐照微泡持续促进AAV病毒颗粒进入细胞,促进高峰在作用后45min至2h,而非声穿孔机制提示的作用当下.超声辐照微泡单独作用或介导AAV转染时,细胞网格蛋白合成增多、细胞浆内聚集颗粒增多.透射电镜结果显示超声辐照微泡介导AAV转染时细胞膜内侧面内吞泡明显增多.抑制网格蛋白介导的细胞内吞途径,部分抑制超声辐照微泡对AAV转染的增强.结论超声辐照微泡增强AAV转染时,激活了细胞内吞活动,增强作用对细胞内吞有依赖性.促进细胞内吞可能是超声辐照微泡促进AAV转染的细胞摄取机制之一.超声辐照微泡刺激细胞内吞可为药物递送和基因递送提供新思路.
【文献类型】中文会议论文
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