人转录因子PU.1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

人转录因子PU.1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定
【作者】刘晨阳，颜文杰，王敏，孙文逵，苏欣，施毅
【作者单位】南方医科大学金陵医院(南京军区南京总医院)呼吸与危重症医学科；上海市第一人民医院呼吸内科
【出处】医学研究生学报
【年份】2016
【卷号】第5期
【页码】465-469
【关键词】PU.1 SPI1 重组腺病毒烟曲霉天然免疫
【ISSN】1008-8199
【分类号】R373
【摘要】目的 PU.1是调控肺泡巨噬细胞天然免疫功能的重要转录因子之一。文中旨在构建并鉴定表达人转录因子PU.1基因的重组腺病毒载体。方法将PU.1基因SPI1和真核表达载体p IRES-EGFP进行双酶切、连接酶连接,PCR扩增目的片段SPI1-IRES-EGFP,与中间质粒p DONR221和腺病毒骨架质粒p Ad/CMV/V5-DEST进行重组,线性化后转染人胚肾293(HEK293)细胞,获得重组腺病毒p AD-SPI1-IRES-EGFP,经过大量扩增后获得高浓度的重组腺病毒。TCID 50法测定重组腺病毒滴度,通过荧光显微镜和实时荧光定量PCR(Real-time q PCR)鉴定PU.1基因在HEK293细胞中的表达。结果菌落PCR、酶切电泳及测序结果均表明重组腺病毒携带有正确的PU.1基因,TCID 50法计算腺病毒滴度为8×1011IU/m L,荧光显微镜下可见明显的绿色荧光,Real-time q PCR转染重组腺病毒组PU.1 mRNA表达量是转染空病毒组的2189.93倍。结论成功构建并获得了高浓度的人转录因子PU.1基因重组腺病毒,为后续研究高表达PU.1在宿主抗烟曲霉感染中的天然免疫作用奠定了基础。
【文献类型】中文期刊
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